超順磁性氧化鐵納米粒子標記心臟內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細胞及活體磁共振

添加日期：2010年5月6日 閱讀：2051

　　急性心肌梗死是冠心病中*危險的疾病類型，目前通過干細胞移植促進心肌細胞再生和血管新生，成為心血管疾病治療的一大熱點。干細胞在體內(nèi)遷移、增殖和分化等生物學(xué)變化是影響療效的重要因素，但目前對體內(nèi)干細胞定量、定位及追蹤其轉(zhuǎn)歸還比較困難。本實驗通過MRI檢查對移植入體內(nèi)超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamaganeticironoxidenanoparticles，SPIO）標記的骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）進行活體示蹤，探討該方法能否作為一種無創(chuàng)的手段來示蹤心臟內(nèi)干細胞的遷移和轉(zhuǎn)歸。
　　
　　１材料與方法
　　
　�。保�１主要試劑和設(shè)備２周齡雄性SD大鼠（８０～１００g，上海動物實驗中心），L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（GIBCO公司），F(xiàn)ITC-CD９０、FITC-CD４５（Serotec公司），SPIO（上海交通大學(xué)納米技術(shù)研究院），cm-DiI（invitrogen公司），倒置光學(xué)顯微鏡（Leica公司），流式細胞儀（Beckman公司），酶標儀（ZD-Ⅱ型，Labsystem公司），動物呼吸機（上海嘉鵬科技公司），磁共振３．０T（美國GE公司）。
　　
　�。保�２方法
　　
　　１．２．１MSCs的分離、培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死，取股骨、脛骨，用L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，１５００r／min離心５min，細胞沉淀加入含１０％胎牛血清（含青霉素１００U／L、鏈霉素１００mg／L）的L-DMEM吹打成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，３７℃、５％CO２培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用貼壁篩選法，２４h**換液，以后每３d更換培養(yǎng)液，當８０％～９０％細胞鋪滿瓶底時，胰酶消化細胞后１∶２傳代。
　　
　�。保�２．２細胞標記取第５代（P５）MSCs，SPIO（７５μg／mL）標記２４h后普魯士藍染色觀察標記率。
　　
　�。保�２．３MTT法測定SPIO對標記細胞活性的影響SPIO標記的MSCs培養(yǎng)至２d，胰酶消化后接種至９６孔培養(yǎng)板，對照組為未標記細胞，每組各１０孔。每孔加MTT溶液（５mg／mL），４h后加DMSO１５０μL／孔，酶標儀（波長５７０nm）測OD值。SPIO標記培養(yǎng)至１５d再作MTT。
　　
　　１．２．４建立急性心肌梗死大鼠模型大鼠麻醉后行氣管插管。胸骨旁左側(cè)做縱切口，鈍性分離各層肌肉，開啟呼吸機（呼吸頻率５０次／min，潮氣量４０mL），剪斷第４肋骨，暴露心臟，結(jié)扎左前降支。
　　
　�。保�２．５細胞移植及分組實驗動物為磁性細胞移植組、納米粒子移植組和非磁性細胞移植組，每組８只；分別在心肌梗死邊緣區(qū)注射SPIO標記的MSCs、SPIO溶液（鐵濃度５０μg／mL）、未標記的MSCs，每只動物４個注射點，共１００μL（３×１０６細胞）。
　　
　　１．２．６MR顯像術(shù)后３、７、１４、２１d行MRI檢查。采用心電門控技術(shù)，T１顯像采用SE序列，掃描時間２min３９s，TE１０ms，TR５００ms，帶寬３１．２５，層厚１．５mm，層間距０．０mm，矩陣２５６×１２８，視野１２cm×１２cm，NEX２．０；T２顯像采用FRFSE序列，掃描時間７min１５s，TR１５００ms，TE３１ms，層厚１．５mm，層間距０．０mm，矩陣１２８×１２８，NEX２４．００，帶寬２０．８３，視野１２cm×１０cm，回波鏈長度９，從心尖至心底一共掃描９～１０層。
　　
　�。保�２．７組織學(xué)檢查術(shù)后３周處死動物，取左心室，固定、脫水、透明、石蠟包埋。冠狀切片作HE染色、普魯士藍染色。
　　
　�。保�３統(tǒng)計學(xué)分析SAS８．０統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較用方差分析、t檢驗。P＜０．０５為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　
　　2結(jié)果
　　
　�。玻�１細胞標記率隨機計數(shù)１０個視野，SPIO標記的MSCs經(jīng)普魯士藍染色后胞漿內(nèi)可見藍色鐵顆粒，標記陽性率達９５％（圖１）。
　　
　�。玻�２SPIO對MSCs活性的影響MTT法測定SPIO標記MSCs后２、１５d與未標記的MSCs（對照組）的OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（２dP＝０．０９６，１５dP＝０．３５７）。
　　
　�。玻�３MRI顯像結(jié)果（１）大鼠梗死部位心肌（包括梗死邊緣區(qū)）T１像信號降低，但不明顯；T２像信號明顯增強。SPIO標記的MSCs在T２像呈低信號（灰色或黑色）（圖２A），與周圍梗死心肌高信號比較而能識別，在T１像不能辨認。（２）磁性細胞移植組術(shù)后３、７、１４d能在MRIT２像清楚顯示的注射點分別為６５．６％、５６．３％、１８．８％（表現(xiàn)為T２像低信號區(qū)），顯影動物數(shù)分別為８、８、５只。至術(shù)后第３周不能顯示低信號的注射點。隨時間的**，低信號區(qū)域由邊界清楚向邊緣模糊改變，低信號區(qū)域范圍有擴大趨勢至*后的消失，信號對比度也隨之降低（圖２A～D）。在T１像無法辨認磁性細胞移植組的移植細胞，且非磁性細胞移植組、納米粒子移植組在第３、７、１４、２１天均未能在T１、T２像檢測到所移植的細胞或納米粒子。
　　
　　２．４組織學(xué)檢查磁性細胞移植組組織切片經(jīng)普魯士藍染色后鏡下可見梗死區(qū)（圖３A）有胞漿含有藍色鐵顆粒的移植細胞，而納米粒子移植組未見藍色鐵顆粒的納米粒子（圖３B）。
　　
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　　干細胞移植后在受體中觀察其遷移和轉(zhuǎn)歸一直是讓人困擾的問題。其中MRI成像時間較長，可觀察細胞的動態(tài)遷徙過程，空間、時間分辨率高，對比度好，可以活體示蹤移植細胞，因而被廣泛應(yīng)用。SPIO是一種新型的MRI對比劑，能顯著增強T２弛豫效能，在磁共振T２像呈低信號（灰色或黑色），因而能被檢測到［１］。SPIO磁敏感性較高，對細胞**性，基本不影響干細胞的活性及增殖和分化能力［２－４］，并且被細胞代謝后能進入正常血漿鐵池，與紅細胞血紅蛋白結(jié)合［５］，并在調(diào)理素作用下被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識別、吞噬細胞攝取。本實驗中SPIO平均直徑３０～４０nm，表面包被葡聚糖，以７５μg／mL鐵濃度孵育能有效標記MSCs達９５％。MTT法結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPIO標記后第２、１５天MSCs活性正常，與以往研究結(jié)果相同。
　　
　　本研究發(fā)現(xiàn)磁性細胞移植組術(shù)后３、７、１４d在MRIT２像清楚顯示的注射點分別為６５．６％、５６．３％、１８．８％，至術(shù)后３周不能顯示低信號注射點。隨時間的**，低信號區(qū)域由邊界清楚向邊緣模糊改變，低信號區(qū)域范圍有擴大趨勢至*后的消失，信號對比度也隨之降低。這說明超順磁性Fe３O４納米粒子可以作為示蹤劑在磁共振下對移植入心肌梗死周邊區(qū)的MSCs進行早期體內(nèi)示蹤。
　　但本研究中移植后３d有約３５％的注射點未能顯影，這可能與這些注射點細胞數(shù)較少有關(guān)。１周后低信號區(qū)域?qū)Ρ榷认陆悼赡苡捎贛SCs分裂及遷移所致，使單位像素內(nèi)的鐵濃度下降［６］。Kraitchman等［６］認為干細胞死亡后被巨噬細胞清除也導(dǎo)致對比度下降。
　　
　　但本研究發(fā)現(xiàn)MSCs死亡后釋放的SPIO可能更多地進入血液循環(huán)被代謝掉，而不是被其他細胞（如巨噬細胞）所吞噬。因為本研究中發(fā)現(xiàn)納米粒子移植組的心肌組織經(jīng)普魯士藍染色未見藍色鐵粒子，說明SPIO直接注射入心肌后大部分進入了血液循環(huán)而不是被巨噬細胞或其他細胞所吞噬。
　　
　　本實驗證實SPIO可以作為示蹤劑在磁共振下對移植入梗死邊緣區(qū)的MSCs進行體內(nèi)追蹤，該方法可作為一種無創(chuàng)的手段來示蹤體內(nèi)干細胞的遷移及轉(zhuǎn)歸。但實驗對象為小動物，有所不足，日后可以對大動物進行更深入的研究。

        責任編輯：小徐     atm-sprinta.com    2010-5-6 9:21:51

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