超順磁性氧化鐵納米粒子標(biāo)記心臟內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及活體磁共振

添加日期：2010年5月6日 閱讀：1945

　　急性心肌梗死是冠心病中*危險(xiǎn)的疾病類型，目前通過干細(xì)胞移植促進(jìn)心肌細(xì)胞再生和血管新生，成為心血管疾病治療的一大熱點(diǎn)。干細(xì)胞在體內(nèi)遷移、增殖和分化等生物學(xué)變化是影響療效的重要因素，但目前對(duì)體內(nèi)干細(xì)胞定量、定位及追蹤其轉(zhuǎn)歸還比較困難。本實(shí)驗(yàn)通過MRI檢查對(duì)移植入體內(nèi)超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamaganeticironoxidenanoparticles，SPIO）標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）進(jìn)行活體示蹤，探討該方法能否作為一種無創(chuàng)的手段來示蹤心臟內(nèi)干細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)歸。
　　
　�。辈牧吓c方法
　　
　�。保�１主要試劑和設(shè)備２周齡雄性SD大鼠（８０～１００g，上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（GIBCO公司），F(xiàn)ITC-CD９０、FITC-CD４５（Serotec公司），SPIO（上海交通大學(xué)納米技術(shù)研究院），cm-DiI（invitrogen公司），倒置光學(xué)顯微鏡（Leica公司），流式細(xì)胞儀（Beckman公司），酶標(biāo)儀（ZD-Ⅱ型，Labsystem公司），動(dòng)物呼吸機(jī)（上海嘉鵬科技公司），磁共振３．０T（美國(guó)GE公司）。
　　
　�。保�２方法
　　
　�。保�２．１MSCs的分離、培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死，取股骨、脛骨，用L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔收集骨髓細(xì)胞，１５００r／min離心５min，細(xì)胞沉淀加入含１０％胎牛血清（含青霉素１００U／L、鏈霉素１００mg／L）的L-DMEM吹打成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，３７℃、５％CO２培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用貼壁篩選法，２４h**換液，以后每３d更換培養(yǎng)液，當(dāng)８０％～９０％細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，胰酶消化細(xì)胞后１∶２傳代。
　　
　　１．２．２細(xì)胞標(biāo)記取第５代（P５）MSCs，SPIO（７５μg／mL）標(biāo)記２４h后普魯士藍(lán)染色觀察標(biāo)記率。
　　
　�。保�２．３MTT法測(cè)定SPIO對(duì)標(biāo)記細(xì)胞活性的影響SPIO標(biāo)記的MSCs培養(yǎng)至２d，胰酶消化后接種至９６孔培養(yǎng)板，對(duì)照組為未標(biāo)記細(xì)胞，每組各１０孔。每孔加MTT溶液（５mg／mL），４h后加DMSO１５０μL／孔，酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)５７０nm）測(cè)OD值。SPIO標(biāo)記培養(yǎng)至１５d再作MTT。
　　
　　１．２．４建立急性心肌梗死大鼠模型大鼠麻醉后行氣管插管。胸骨旁左側(cè)做縱切口，鈍性分離各層肌肉，開啟呼吸機(jī)（呼吸頻率５０次／min，潮氣量４０mL），剪斷第４肋骨，暴露心臟，結(jié)扎左前降支。
　　
　　１．２．５細(xì)胞移植及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為磁性細(xì)胞移植組、納米粒子移植組和非磁性細(xì)胞移植組，每組８只；分別在心肌梗死邊緣區(qū)注射SPIO標(biāo)記的MSCs、SPIO溶液（鐵濃度５０μg／mL）、未標(biāo)記的MSCs，每只動(dòng)物４個(gè)注射點(diǎn)，共１００μL（３×１０６細(xì)胞）。
　　
　　１．２．６MR顯像術(shù)后３、７、１４、２１d行MRI檢查。采用心電門控技術(shù)，T１顯像采用SE序列，掃描時(shí)間２min３９s，TE１０ms，TR５００ms，帶寬３１．２５，層厚１．５mm，層間距０．０mm，矩陣２５６×１２８，視野１２cm×１２cm，NEX２．０；T２顯像采用FRFSE序列，掃描時(shí)間７min１５s，TR１５００ms，TE３１ms，層厚１．５mm，層間距０．０mm，矩陣１２８×１２８，NEX２４．００，帶寬２０．８３，視野１２cm×１０cm，回波鏈長(zhǎng)度９，從心尖至心底一共掃描９～１０層。
　　
　　１．２．７組織學(xué)檢查術(shù)后３周處死動(dòng)物，取左心室，固定、脫水、透明、石蠟包埋。冠狀切片作HE染色、普魯士藍(lán)染色。
　　
　�。保�３統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SAS８．０統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用方差分析、t檢驗(yàn)。P＜０．０５為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　
　　2結(jié)果
　　
　　２．１細(xì)胞標(biāo)記率隨機(jī)計(jì)數(shù)１０個(gè)視野，SPIO標(biāo)記的MSCs經(jīng)普魯士藍(lán)染色后胞漿內(nèi)可見藍(lán)色鐵顆粒，標(biāo)記陽性率達(dá)９５％（圖１）。
　　
　�。玻�２SPIO對(duì)MSCs活性的影響MTT法測(cè)定SPIO標(biāo)記MSCs后２、１５d與未標(biāo)記的MSCs（對(duì)照組）的OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（２dP＝０．０９６，１５dP＝０．３５７）。
　　
　�。玻�３MRI顯像結(jié)果（１）大鼠梗死部位心�。ò�括梗死邊緣區(qū)）T１像信號(hào)降低，但不明顯；T２像信號(hào)明顯增強(qiáng)。SPIO標(biāo)記的MSCs在T２像呈低信號(hào)（灰色或黑色）（圖２A），與周圍梗死心肌高信號(hào)比較而能識(shí)別，在T１像不能辨認(rèn)。（２）磁性細(xì)胞移植組術(shù)后３、７、１４d能在MRIT２像清楚顯示的注射點(diǎn)分別為６５．６％、５６．３％、１８．８％（表現(xiàn)為T２像低信號(hào)區(qū)），顯影動(dòng)物數(shù)分別為８、８、５只。至術(shù)后第３周不能顯示低信號(hào)的注射點(diǎn)。隨時(shí)間的**，低信號(hào)區(qū)域由邊界清楚向邊緣模糊改變，低信號(hào)區(qū)域范圍有擴(kuò)大趨勢(shì)至*后的消失，信號(hào)對(duì)比度也隨之降低（圖２A～D）。在T１像無法辨認(rèn)磁性細(xì)胞移植組的移植細(xì)胞，且非磁性細(xì)胞移植組、納米粒子移植組在第３、７、１４、２１天均未能在T１、T２像檢測(cè)到所移植的細(xì)胞或納米粒子。
　　
　�。玻�４組織學(xué)檢查磁性細(xì)胞移植組組織切片經(jīng)普魯士藍(lán)染色后鏡下可見梗死區(qū)（圖３A）有胞漿含有藍(lán)色鐵顆粒的移植細(xì)胞，而納米粒子移植組未見藍(lán)色鐵顆粒的納米粒子（圖３B）。
　　
　�。秤懻�
　　
　　干細(xì)胞移植后在受體中觀察其遷移和轉(zhuǎn)歸一直是讓人困擾的問題。其中MRI成像時(shí)間較長(zhǎng)，可觀察細(xì)胞的動(dòng)態(tài)遷徙過程，空間、時(shí)間分辨率高，對(duì)比度好，可以活體示蹤移植細(xì)胞，因而被廣泛應(yīng)用。SPIO是一種新型的MRI對(duì)比劑，能顯著增強(qiáng)T２弛豫效能，在磁共振T２像呈低信號(hào)（灰色或黑色），因而能被檢測(cè)到［１］。SPIO磁敏感性較高，對(duì)細(xì)胞**性，基本不影響干細(xì)胞的活性及增殖和分化能力［２－４］，并且被細(xì)胞代謝后能進(jìn)入正常血漿鐵池，與紅細(xì)胞血紅蛋白結(jié)合［５］，并在調(diào)理素作用下被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別、吞噬細(xì)胞攝取。本實(shí)驗(yàn)中SPIO平均直徑３０～４０nm，表面包被葡聚糖，以７５μg／mL鐵濃度孵育能有效標(biāo)記MSCs達(dá)９５％。MTT法結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPIO標(biāo)記后第２、１５天MSCs活性正常，與以往研究結(jié)果相同。
　　
　　本研究發(fā)現(xiàn)磁性細(xì)胞移植組術(shù)后３、７、１４d在MRIT２像清楚顯示的注射點(diǎn)分別為６５．６％、５６．３％、１８．８％，至術(shù)后３周不能顯示低信號(hào)注射點(diǎn)。隨時(shí)間的**，低信號(hào)區(qū)域由邊界清楚向邊緣模糊改變，低信號(hào)區(qū)域范圍有擴(kuò)大趨勢(shì)至*后的消失，信號(hào)對(duì)比度也隨之降低。這說明超順磁性Fe３O４納米粒子可以作為示蹤劑在磁共振下對(duì)移植入心肌梗死周邊區(qū)的MSCs進(jìn)行早期體內(nèi)示蹤。
　　但本研究中移植后３d有約３５％的注射點(diǎn)未能顯影，這可能與這些注射點(diǎn)細(xì)胞數(shù)較少有關(guān)。１周后低信號(hào)區(qū)域?qū)Ρ榷认陆悼赡苡捎贛SCs分裂及遷移所致，使單位像素內(nèi)的鐵濃度下降［６］。Kraitchman等［６］認(rèn)為干細(xì)胞死亡后被巨噬細(xì)胞清除也導(dǎo)致對(duì)比度下降。
　　
　　但本研究發(fā)現(xiàn)MSCs死亡后釋放的SPIO可能更多地進(jìn)入血液循環(huán)被代謝掉，而不是被其他細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）所吞噬。因?yàn)楸狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)納米粒子移植組的心肌組織經(jīng)普魯士藍(lán)染色未見藍(lán)色鐵粒子，說明SPIO直接注射入心肌后大部分進(jìn)入了血液循環(huán)而不是被巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞所吞噬。
　　
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPIO可以作為示蹤劑在磁共振下對(duì)移植入梗死邊緣區(qū)的MSCs進(jìn)行體內(nèi)追蹤，該方法可作為一種無創(chuàng)的手段來示蹤體內(nèi)干細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)歸。但實(shí)驗(yàn)對(duì)象為小動(dòng)物，有所不足，日后可以對(duì)大動(dòng)物進(jìn)行更深入的研究。

        責(zé)任編輯：小徐     www.atm-sprinta.com    2010-5-6 9:21:51

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